CAR-T（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy），即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。它是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，能够精准、高效，且有希望治愈癌症的免疫治疗方法。目前，主要有两种病毒载体用于CAR-T细胞基因转导：γ逆转录病毒载体和慢病毒载体。
慢病毒是一种有包膜的RNA病毒，直径为80-120nm，呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜，里面依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和各种酶，包括逆转录酶、整合酶和蛋白酶。慢病毒基因组结构复杂。以HIV-1为例，它是一种单链RNA病毒，其基因组长度约为9.7kb。基因组两端各有一个长末端重复序列(LTR)，中间包括gag、 pol、env 3个结构基因，tat、rev 2个调节基因，nef、vif、vpr、vpu 4 个辅助基因。
图1：慢病毒的结构
(资料图片仅供参考)
图2：HIV的基因结构
目前基因治疗产品所用慢病毒载体均是非复制型的，但在病毒包装过程中，可能会由于同源或非同源重组等机制产生复制型慢病毒(RCL)。出于安全、有效、质量可控的考虑，应当对该类病毒进行检测，以避免在人体内无控地自我复制，造成伤害，防止发生临床安全性隐患事件。
据文献报道[1]，复制型慢病毒检测方法主要包括以下几种：
01细胞培养法与能够将弱毒株扩增至高滴度的细胞系C8166共培养，并用ELISA法、qPCR和PERT等分子测定法进行病毒检测。具体步骤包括扩增阶段和指示阶段，扩增阶段是将待测样品与C8166细胞共培养，将培养物至少传代5次，培养3周，随后，指示阶段将细胞培养物与新的C8166细胞一起孵育，7天后对指示期的培养基或细胞，进行psi-gag／vsv-g PCR，ELISA p24，PERT检测。
1P24的ELISA方法P24 ELISA的方法适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成RCL的检测，但如果VSV-G包膜质粒与来源于其他病毒的gal-pol基因功能组件之间发生重组，如内源性人类逆转录病毒可能存在于载体生产细胞中，这种情况下将因为包装质粒与载体生产细胞内源性病毒基因组发生重组，形成不表达P24衣壳蛋白的假性病毒，这种情况下P24 ELISA方法将不再适用。
图3：P24 ELISA的原理
2PCR／Q-PCR法采用实时定量PCR方法(Q-PCR)测定VSV-G基因序列，这种测定方法可以作为P24 ELISA方法的互补终点分析方法，即对指示期样品采用2种不同原理的检测方法以防止假阳性／假阴性的发生。应用Q-PCR方法时，需要关注基于VSV-G检测分析过程中可能会由于存在污染的病毒序列(大部分可能来源于载体生产中的瞬时转染)造成检测误差。同时通过PCR方法可以检测由载体质粒和包装质粒重组产生的psi-gag序列。
图4：Q-PCR的原理
3PERT法当RCL进行扩增后，也可应用PERT检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景，主要优点是它检测的逆转录酶功能(RT)在任何RCL的复制中都至关重要，它可以用来检测RCL相关的不同结构的逆转录病毒。
02实时定量PCR方法(Q-PCR法)目前许多CAR-T申报企业采用Q-PCR／PCR方法直接测定终产品中的VSV-G序列或psi—gag序列，考虑到细胞产品一般需要新鲜输注或快速冻存的特殊性，采用基于细胞培养方法，时间周期较长，建议在细胞产品制备过程中进行全面控制(如对慢病毒载体及生产终末细胞采用基于细胞培养方法测定RCL，以确保生产工艺过程中不存在RCL的风险)，细胞终产品阶段可采用快速放行方法(如PCR方法)。基于Q-PCR法测定复制型慢病毒载体，主要是针对VSV-G序列设计定量引物，通过绘制标准曲线，对RCL予以定量。
03合胞体形成测定法合胞体是病毒感染的一种现象。有的病毒感染了宿主细胞后，会促使宿主细胞和周围同类的细胞融合。其形成过程如下：病毒是通过膜融合进入宿主细胞，即这些病毒表面的糖蛋白有让磷脂双分子层融合的能力，而病毒释放的时候，宿主细胞的表面又被病毒的糖蛋白修饰。如果这时旁边有同样的细胞，不管这些细胞有没有被病毒感染，它们表面都有受体。所以宿主细胞表面的糖蛋白也可以和这些受体结合，触发细胞膜的融合，这就是合胞体形成的过程。
图5：合胞体形成的原理
合胞体法测定RCV(复制型病毒)的过程包括：将包装质粒、包膜质粒和转移载体共转染至TE671细胞(人横纹肌肉瘤细胞)，测定培养物上清液中载体滴度；然后将培养物与HIV-1感染最敏感的细胞系之一MT4细胞共培养；在共培养之后，监测MT4细胞的合胞体形成，培养上清液进行HIV-1逆转录酶(RT)测定。
04HIV-1的标志物补救测定法标志物补救测定法原理：在标志物补救测定法中，选用的细胞系应含有易于识别的标记基因的慢病毒载体(复制缺陷型病毒，一般不含有包膜基因，并在Nef结构区域插人IRES—eYFP基因作为标记基因)。该方法的具体检测过程及原理如下：将“测试样品”用于转导Alka-rescue(293T-AIB，含有AP-IRES—blastir抗性盒的整合的复制缺陷型HIV)细胞，然后将细胞传代数周，以允许任何潜在RCL扩增后收集细胞上清液。如果存在RCL，它将作为辅助病毒，调节编码杀稻瘟菌素抗性(blastir)和碱性磷酸酶(AP)基因表达，并形成整合型前病毒。将收获的上清液转导初始细胞系人成骨瘤细胞(HOS)之后，对含有AP基因的细胞进行染色并测定含有AP病毒的滴度。
图6：HIV-1的标志物补救测定法
目前针对复制型慢病毒（RCL）检测方法差异很大，例如，PCR／QPCR的方法会因为细胞或质粒DNA残留导致假阳性；合胞体形成测定法需要慢病毒具有完整的能力并且包含Env元件，该方法的灵敏度还未得到验证；标志物补救测定法尚不清楚来自载体生产过程中的RCL是否会激活标志物；逆转录酶活性测定法(PERT)不能区分RCL和载体颗粒，且细胞中固有的内源性病毒颗粒也会影响检测结果的判断。
根据FDA 2006年发布的关于RCR检测的指南和2018年最新更新的检测指南征求意见稿，目前RCR／RCL检测的金标准是共培养法，即将测试样品(病毒载体上清液、生产终末细胞、体外转导细胞等)与允许细胞系进行共培养，至少5次传代以扩增任何潜在的RCR／RCL，然后在指示阶段，通过检测特异性核酸、蛋白的方法进行测定。
参考文献：
[1]崔靖, 韦薇, & 罗建辉. (2020). 复制能力慢病毒检测方法的研究进展. 中国新药杂志 2019年28卷22期, 2718-2723页, ISTIC PKU CSCD.
[2]C Nóbrega, Mendona, L., & Matos, C.. (2020). A Handbook of Gene and Cell Therapy.
[3] Falzone, L. , Gattuso, G. , Tsatsakis, A. , Spandidos, D. , & Libra, M. . Current and innovative methods for the diagnosis of covid19 infection (review). International journal of molecular medicine, 47(6), 100.
关于恒驭生物恒驭生物是一家由优秀技术及质量团队创立，致力于为全球创新药企提供生物安全检测及相关工艺验证、方法开发服务及产品的CXO平台，提供满足中美欧三地申报要求的病毒清除工艺验证、细胞库检定、批次放行检测等优质服务。
恒驭生物于多地布局建设完成总计6000多平的实验场地，其中P2/ P2 plus实验室面积约3000平米，具备8个独立分区、14套独立空调系统、实时监控EMS系统、透射电子显微镜、AKTA avant层析系统、AKTA pure层析系统、无菌正压隔离系统、无菌负压隔离系统、超100台生物安全柜等，满足中美欧等多地法规的设计要求。
恒驭生物严格遵循GXP、CNAS质量管理体系，对人员、厂房设施设备、物料及环境控制、方法学开发确认及验证、试验方案和执行管理等各质量要素进行了体系化管理，有效保障年均超过400个项目的有效执行，为国内及出海项目的IND及BLA申报保驾护航。
恒驭生物以领先业内的严谨检测、敏捷周期、多地申报、快速响应、系统管理及数据保密等服务，用可靠的检测数据守护全球合作伙伴的创新研发之路！
扫码关注热线电话：400-021-5980 邮箱：service@hydetc.com